?
資訊詳情
策略探討 | 剪接因子SRSF1如何影響全身性紅斑狼瘡的T細胞過度活躍
發布時間:2019-11-08 15:02:48   資訊來源:JCI, 2019

【主要看點】

通過RNA測序、熒光素酶檢測、免疫印跡、qRT-PCR等實驗技術,發現并驗證了主要研究因子SRSF1可促進PTEN的表達,從而抑制mTORC1信號通路的激活,最終對T細胞的過度活躍產生影響。

 

【參考來源】

JCI, 2019, Splicing factor SRSF1 controls T cell hyperactivity and systemic autoimmunity

Fig.4 T cells from Srsf1-cKO mice exhibit increased activation of the mTORC1 pathway and reduced expression of PTEN.

 

【關鍵知識】

mTOR信號通路:哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是一種非典型的絲氨酸/蘇氨酸激酶,存在于兩個不同的復合體中。第一個為mTOR復合體1mTORC1),由mTORRaptorGβLDEPTOR構成;第二種復合體是mTOR復合體2mTORC2),由mTORRictorGβLSin1PRR5/Protor-1DEPTOR構成。mTOR信號轉導異常見于多種疾病,如癌癥、心血管疾病和糖尿病。

PTEN具有磷酸酯酶的活性,可通過拮抗酪氨酸激酶等磷酸化酶的活性,可抑制腫瘤的發生發展。

3’-UTR熒光素酶檢測:將研究基因mRNA3’-UTR插入帶有熒光素酶報告基因的載體中,其后進行相關刺激,通過檢測熒光強度觀察不同刺激手段下對熒光素酶表達的影響,從而可測定上游刺激對下游靶基因在轉錄水平的影響。

 

【結果展示】

Step 1流式分選Srsf1-cKO 小鼠、野生型小鼠的T細胞,其后分別進行RNA測序,分析各關鍵通路因子的表達差異。

實驗結果顯示,Srsf1基因被敲除后,T細胞中PI3K/AKT/mTOR信號通路的幾個關鍵因子均有不同程度的影響;其中,該通路的抑制因子PTEN的表達明顯下調。


Step 2通過Western Blot,檢測mTOR信號通路中關鍵活化因子的磷酸化情況,確定在Srsf1-cKO 小鼠T細胞中mTOR信號通路的激活情況。

實驗結果顯示,Srsf1基因被敲除的小鼠T細胞中,S6、AKT在自身表達情況無明顯變化的情況下,其磷酸化情況明顯上升,即Srsf1敲除后增加了mTOR信號通路的激活。

Step 3為進一步確定在Srsf1-cKO 小鼠T細胞中PTEN表達下調的原因,通過qRT-PCRWestern Blot在其mRNA及蛋白水平上進行驗證。

實驗結果顯示,Srsf1-cKO 小鼠T細胞中PTEN的mRNA、蛋白表達均有明顯的下調。

Step 4由于之前已有報道顯示SRSF1一般是通過與下游基因3’-UTR結合,在轉錄后調控水平上影響基因的表達,故在此選擇進行3’-UTR熒光素酶檢測,確定SRSF1調控PTEN表達水平的機制。

實驗結果顯示,SRSF1主要作用于Pten mRNA 3’-UTR,從而影響PTEN蛋白的表達;SRSF1的過表達可促進PTEN的表達,SRSF1的被敲除后PTEN的表達明顯被抑制,且在SRSF1回復后PTEN的表達也隨之回復。


【相關試劑】

Phospho-RPS6-S240/244 Antibody Kit

品牌貨號:ABclonal,RK04081

規格報價:50uL,1680元


Phospho-Akt1-S473 Rabbit mAb

品牌貨號:ABclonal,AP0637

規格報價:50uL,1700元


WB檢測試劑盒

品牌貨號:凱基,KGP1201

規格報價:10 tests,945元


Super一步法RT-PCR(M-MLV)試劑盒

品牌貨號:凱基,KGA1336

規格報價:20 tests,373元


Super一步法RT-PCR(AMV)試劑盒

品牌貨號:凱基,KGA1331

規格報價:20 tests,441元


KeygenTrans 新型轉染試劑

品牌貨號:凱基,KGD031

規格報價:0.3 mL,788元


雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒

品牌貨號:凱基,KGAF040

規格報價:100 tests,840元

 

更多試劑耗材、實驗服務信息可與我們聯系,廣州杰特偉為您提供一站式完整科學的解決方案!
360網站安全檢測平臺
足球彩票半全场什么意思